2019年1月13日 星期日

生物技術資金創紀錄的一年

發表於PharmaTimes雜誌 - 2018年12月




通過

約翰卡西迪


2018年是私營資金佔據該行業頭條新聞的一年,也是私人投資生物科技創紀錄的一年2018年是私人輪融資佔據該行業頭條新聞的一年,也是私人投資生物技術創紀錄的一年。 



在前10個月,135億美元的風險投資湧入該行業,輕鬆超過2017年的110億美元全年創紀錄的記錄。該行業不斷增長的投資在一定程度上反映在風險資本(VC)融資中--97.7億美元為2017年籌集的資金專注於生物技術,但相比之下,2018年前10個月已經籌集了93.2億美元。



有趣的是,這項投資越來越多地集中在擁有投資生物技術的良好記錄的大型既定基金上。 此外,過去一年中這些投資的另一個有趣特點是資金已經部署在更少的機會上,反映了該行業的新動態。


生物技術長期以來一直是“贏得大家”的空間,少數幾個成功的出口為風險投資提供了最大的回報,看起來投資者情緒似乎在這個方向上變得更加突出。 在投資少數公司的同時,投資者正在編寫更大的支票,這是一種動力,需要在評估機會和管理團隊時保持紀律,同時部署更大和更大的資金。 結果是風險投資公司通常希望在較少質量較高的公司中佔據更大的位置,這表明他們更有信心能夠選出獲勝者,並且他們對少數精選生物技術公司的集中支持將降低他們失敗的可能性。

無論是通過併購成功進行生物技術退出,以及重要的科學和臨床成就,來自該行業的積極新聞流的影響,仍然激發了專家和通才等對該行業的興趣。 因此,可用於質量機會的資金過剩,風險投資者不得不更加努力地向有吸引力的生物技術公司提起訴訟,並願意接受更高的估值或冒險輸給其他投資者。 儘管上述情況在美國已有一段時間,但由於專業風險投資公司繼續籌集更多資金並與美國和中國的通才和外國投資者一起投資,因此它也成為歐洲的常態。 英國公司在轉型科學方面處於領先地位,並已籌集到大量資金(見表1。


總體而言,2018年對生物技術的持續興趣,對於希望籌集資金的生物技術公司而言,融資的增加應該是積極的,同時導致風險投資之間的競爭越來越激烈。 這些備受追捧的交易正在獲得更高的估值,使公司能夠在不久的將來進一步擴展現金跑道並降低融資風險。 這是個好消息。 該資本將允許公司進一步推進其計劃,並可能開發並為全球患者帶來轉化療法和療法。

John Cassidy是倫敦上市公司Arix Bioscience的投資助理


資料來源:http://www.pharmatimes.com/magazine/2018/december_2018/a_record-breaking_year_for_biotech_funding




2019年1月3日 星期四

植入式設備可實現響應式膀胱控制


新聞和觀點  2019年1月2日

持續電刺激神經以治療疾病的植入物可導致脫靶效應和疼痛。 使用光來調節轉基因神經細胞活性的植入物可能提供一種解決方案。
艾倫T.羅氏

生物電子學的進步已經在使用植入的電子設備治療疾病方面取得了進展。 在臨床中,調節控制膀胱功能2的神經細胞的這種方法可以治療稱為膀胱過度活動症的病症,其特徵在於經常迫切需要排尿,有時伴有相關的尿失禁,以及異常大量的膀胱排空事件。 用於這種神經調節的常規方法是施加連續的電刺激; 然而,這並不僅僅影響相關的神經細胞,並且可能導致疼痛和脫靶效應3。 在自然中寫作 ,Mickle 等 。 圖4描述了解決這個問題的潛在方法 - 一種能夠感知和控制大鼠膀胱功能的微型植入裝置。

作者沒有通過直接使用電刺激來調節神經活動,而是利用了一種稱為光遺傳學的成熟技術,其中膀胱中的神經細胞經過基因改造以表達可以抑制神經細胞活化的光敏受體蛋白。 Mickle及其同事在每隻動物的膀胱周圍植入了一個可伸縮的高精度應變傳感器,用於測量膀胱周長隨時間的變化。 氣囊傳感器連接到發光二極管(LED)。 這些部件通過導線連接到植入腹部的柔性基站裝置。 基站通過與外殼籠下方的元件相互作用而無線供電(圖1)。
圖1 | 一種減輕膀胱功能障礙的工程系統。 Mickle 等人 。 圖4已經開發出一種方法,該方法使用基因工程和植入裝置來產生自調節系統(稱為閉環系統),其調節神經細胞活性以治療大鼠的器官功能障礙。 作者使用經基因工程改造的動物在其膀胱中的感覺神經細胞中表達光敏蛋白。 植入膀胱的可拉伸傳感器監測器官的周長,並附著在發光二極管(LED)上。 這些膀胱組件通過導線連接到腹部的植入式基站電子設備,該設備由動物籠中的發射器無線供電。 基站從膀胱的拉伸傳感器接收信息並將其無線傳輸到跟踪膀胱數據的外部用戶接口設備。 如果數據表明異常頻繁的膀胱排空,這發生在動物接受分子環磷酰胺(未示出)時,外部裝置將無線信號發送回基站,導致LED開啟。 它們的光照抑制了基因工程神經細胞,從而防止了異常高頻率的排尿。


膀胱拉伸傳感器將數據傳送到基站,然後基站將該信息無線傳輸到記錄和監測膀胱功能的外部設備。 如果外部設備檢測到膀胱功能異常的跡象 - 例如,不必要的頻繁膀胱排空 - 它將信號無線地發送到基站。 這使得LED開啟,導致光介導的膀胱中感覺神經元的抑制,從而影響膀胱排空的頻率。 這種類型的佈置稱為閉環系統,其中系統的輸出 - 在這種情況下,氣囊尺寸改變 - 被監視並作為輸入信號反饋到系統中。 這在這種情況下是有利的,因為它僅在需要時觸發神經細胞活動的調節,從而提供有針對性的實時控制系統。

作者測試了他們的系統對於管理大鼠注射藥物環磷酰胺時出現的膀胱功能障礙的有效性。 與未接受環磷酰胺的動物相比,這引起炎症反應和膀胱排空發作次數的增加。 作者的系統檢測到膀胱排空的功能失調模式,從而抑制器官的感覺神經並恢復正常的排尿頻率模式。
閱讀論文:用於光遺傳學外周神經調節的無線閉環系統

Mickle及其同事的設備是可能的,因為許多最近開發的相關工具。 作者需要植入式柔性傳感器和可拉伸電子設備,能夠以不影響器官功能的方式檢測器官尺寸變化5 - 8 。 光遺傳學,無線數據和能量轉移領域的發展也提供了系統運行所需的關鍵技術。

作者為其係統選擇的膀胱過度活動功能動物模型揭示了該技術的複雜功能。 是否應該探索這種多功能平台是否適合治療其他疾病。 Mickle及其同事的工作可能對緩解器官功能障礙和調節疼痛的努力產生重大影響。 然而,通過使用作者的方法,不可能確定膀胱感染引起的疼痛和可能與膀胱功能障礙相關的炎症是否可以減輕,並且使用這種方法抑制感覺神經的效果應該是一個主題進一步調查。

先前已經顯示9 ,對於手術切除的兔心臟在實驗室中保持功能,圍繞心臟的可伸展的套管狀電子裝置可以檢測諸如溫度,pH和機械應變的數據。 如果可以修改這種心臟監測設備以結合Mickle及其同事開發的閉環控制系統,它可能提供實時反饋,可用於調節植入泵或套管的活動(稱為心室輔助設備) )幫助心臟衰弱的人10,11 。 或者,有一天,可以使用閉環系統來檢測胃的伸展並傳遞這些信息以增強飽腹感,作為控制肥胖的一種方式。 這種閉環系統是否有可能適應醫療設備,使神經損傷引起的大便失禁患者能夠正常排空腸道?


Mickle及其同事開發的方法有幾個關鍵特徵。 使用光學系統調節神經細胞功能比電刺激提供更大的穩定性和時間精確度。 符合器官表面的柔性電子器件提供穩定的界面,其中電子設備匹配相關組織的機械特性。 如果可以使用來自物理線索的輸入,例如器官幾何形狀的變化,血流動力學或閉環治療裝置中的溫度,這將開闢一種思考如何利用生物傳感用於臨床目的的新方法。 與使用諸如血糖監測器中的化學信號或心臟起搏器中的電信號之類的線索的當前傳感器技術相反,相反於關注易於測量的物理線索可以顯著增加評估器官功能的方式的數量。

這項研究提供了一個突破性的演示,說明完全閉環系統如何感知和控制器官功能,但有一些缺點。 無線供電機制需要放置在動物籠子下面的裝置,因此需要替代策略來為臨床使用提供無線能量源。 另一個缺點是光遺傳學方法依賴於細胞的遺傳修飾。 在這種情況下,在通過皮膚和肌肉進行手術切口以暴露膀胱後,通過注射到膀胱壁中,使用病毒將工程化基因導入膀胱細胞。 此外,該步驟在裝置植入之前進行一段時間,並且重複進行手術的要求可能對該方法的臨床實施產生障礙。 此外,如果系統的一部分發生故障並需要更換,則需要額外的侵入性外科手術來解決問題。

身體對膀胱周圍可伸展傳感器存在的長期反應尚不清楚。 還擔心可能發生相關的組織損傷,例如過量纖維結締組織的形成(纖維化),或者是否可能出現對周圍組織的粘連,這可能限制植入功能並對器官功能產生不利影響。

Mickle及其同事通過開發一種能夠對神經系統進行特定和穩定刺激的治療系統,為該領域邁出了重要一步。 如果光遺傳學方法被批准用於特定的臨床應用,那麼這種類型的閉環系統可能在推動轉變為使用這種策略來治療人類疾病方面發揮關鍵作用。

參考
1。Birmingham,K。 等。 Nature Rev. Drug Discov。 13,399-400(2014)。
考研 文章 谷歌學術
2。Siegel,SW 等人。 泌尿學 56 (增刊1),87-91(2000)。
考研 文章 谷歌學術
3。Kavvadias,T.,Huebner,M.,Brucker,SY&Reisenauer,C。Arch 。 Gynecol。 婦產科。 295,951-957(2017)。
考研 文章 谷歌學術
4。Mickle,AD 等。 自然 https://doi.org/10.1038/s41586-018-0823-6(201)。
文章 谷歌學術
5。Krishnan,SR 等人。 小 14,1803192(2018)。
文章 谷歌學術
6。Krishnan,SR 等人。 科學。 譯。 醫學。 10 ,eaat8437(2018)。
考研 文章 谷歌學術
7。陳,X。 等。 自然共同。 9,1690(2018)。
考研 文章 谷歌學術
8。Nan,K。 等。 科學。 進階 4 ,eaau5849(2018)。
考研 文章 谷歌學術
9。徐,L。 等。 自然共同。 5,3329(2014)。
考研 文章 谷歌學術
10。Gustaffson,F。&Rogers,JG Eur。 J. Heart Failure 19,595-602(2017)。
文章 谷歌學術
11。羅氏,ET 等。 科學。 譯。 醫學。 9 ,eaaf3925(2017)。

來源:https://www.nature.com/articles/d41586-018-0781



2018年12月28日 星期五

靜水壓力產生的活性氧物質誘導軟骨沉澱培養物中的骨關節炎病症

發布時間: 2018年11月19日


Abstract 概要




Hydrostatic pressure-generated reactive oxygen species induce osteoarthritic conditions in cartilage pellet cultures



Osteoarthritis (OA) is one of the most common causes of disability and represents a major socio-economic burden. Despite intensive research, the molecular mechanisms responsible for the initiation and progression of OA remain inconclusive. In recent years experimental findings revealed elevated levels of reactive oxygen species (ROS) as a major factor contributing to the onset and progression of OA. Hence, we designed a hydrostatic pressure bioreactor system that is capable of stimulating cartilage cell cultures with elevated ROS levels. Increased ROS levels in the media did not only lead to an inhibition of glycosaminoglycans and collagen II formation but also to a reduction of already formed glycosaminoglycans and collagen II in chondrogenic mesenchymal stem cell pellet cultures. These effects were associated with the elevated activity of matrix metalloproteinases as well as the increased expression of several inflammatory cytokines. ROS activated different signaling pathways including PI3K/Akt and MAPK/ERK which are known to be involved in OA initiation and progression. Utilizing the presented bioreactor system, an OA in vitro model based on the generation of ROS was developed that enables the further investigation of ROS effects on cartilage degradation but can also be used as a versatile tool for anti-oxidative drug testing.

骨關節炎(OA)是導致殘疾的最常見原因之一,並且是主要的社會經濟負擔。 儘管進行了深入研究,但是負責OA起始和進展的分子機制尚無定論。 近年來,實驗結果顯示活性氧(ROS)水平升高是導致OA發生和發展的主要因素。 因此,我們設計了一種靜水壓力生物反應器系統,能夠刺激具有升高的ROS水平的軟骨細胞培養物。 培養基中ROS水平的增加不僅導致糖胺聚醣和膠原蛋白II形成的抑制,而且還導致軟骨形成間充質乾細胞沉澱培養物中已形成的糖胺聚醣和膠原蛋白II的減少。 這些作用與基質金屬蛋白酶的活性升高以及幾種炎性細胞因子的表達增加有關。 ROS激活不同的信號傳導途徑,包括已知參與OA起始和進展的PI3K / Akt和MAPK / ERK。 利用所提出的生物反應器系統,開發了基於ROS產生的OA 體外模型,其能夠進一步研究ROS對軟骨降解的影響,但也可以用作抗氧化藥物測試的通用工具。



Introduction 介紹 



骨關節炎(OA)是最常見的關節炎類型,影響25%的成年人群。 據預測,僅在美國,到2020年將有大約5000萬人患OA. 1,2 。 這種退行性關節病主要在老年人中觀察到,這在歷史上導致OA是一種簡單的關節軟骨“磨損”疾病的假設3,4 。 據信,關節軟骨的損失隨後導致生物力學改變與細胞變化相結合,隨著時間的推移導致軟骨下骨,滑膜,半月板,韌帶,關節周圍肌肉和神經的嚴重變化5 。 該假設由體內模型的結果支持,其中例如通過橫切前十字韌帶6,7來誘導膝關節的機械不穩定性以促進軟骨結構的過度磨損。




近來,OA越來越多地被認為是引起關節軟骨細胞穩態失衡的炎症過程,最終導致關節軟骨的進行性喪失和破壞。 與類風濕性關節炎(RA)類似,OA與滑膜炎症相關,但通常程度較小(滑液白細胞數量少於RA)。 相反,OA的特徵在於高水平的許多促炎細胞因子和趨化因子,其導致產生細胞外基質降解酶,例如負責關節軟骨損失的基質金屬蛋白酶(MMP) 5 。


儘管進行了20多年的研究,但是對OA起始和進展負責的分子機制仍然知之甚少。 然而,現在人們普遍認為,OA的發病機制遠比“磨損”複雜得多,並且過度和異常關節負荷形式的機械因素起著至關重要的作用。


在這方面,已經建立了不同的體內和體外 OA模型來破譯導致該疾病的特定因子的作用。


大多數體外 OA模型使用軟骨外植體,原代(骨關節炎)軟骨細胞或間充質乾細胞(MSC)分化成軟骨細胞譜系,並且可以根據分解代謝過程開始時使用的觸發進行分組。 大多數研究涉及單獨使用細胞因子治療(如添加促炎細胞因子IL-1β或TNF-α)或與物理刺激相結合,如滲透壓,物理損傷/變形和機械加載方式。 8,9,10 。 在這方面,已顯示循環流體靜壓增加一氧化氮的產生以及蛋白多醣合成11和改變IL-1β處理的骨關節炎軟骨細胞的細胞超微結構12,13 。 這些發現強調了機械刺激對於不僅健康而且還有骨關節炎軟骨細胞的止血的重要性。


在過去的十年中,許多研究表明活性氧(ROS)參與OA的發生和發展[ 14,15] 。 到目前為止,只有少數研究使用適當的生理體外模型來模擬升高的ROS水平以產生OA模型。 在選擇的研究中,通過應用H 2 O 2 16,17,18,19,20產生骨關節炎軟骨細胞,其基於嗜中性粒細胞和巨噬細胞或軟骨細胞自身在發炎的膝關節中體內產生H 2 O 2 。 在這方面,已經顯示軟骨細胞通過激活NADPH氧化酶(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶) 21產生超氧自由基,其隨後可以分解成H 2 O 2 。 此外,Regan 等人 。 研究表明,與來自健康患者的樣本相比,OA患者的關節液的特徵是細胞外超氧化物歧化酶(SOD)水平顯著降低[ 22,23] ,表明不受控制的超氧化物水平在OA起始中起關鍵作用。


在這裡,我們證明通過壓縮空氣施加靜水壓力(HP)誘導產生高水平的超氧化物和其他ROS物質(通過電子順磁共振測量確定),其隨後通過下調軟骨表達阻礙MSC顆粒培養物的軟骨形成發育。 - 特異性蛋白質,例如II型膠原蛋白和糖胺聚醣,以及上調I型膠原蛋白,基質金屬蛋白酶和炎性細胞因子的表達。 此外,關鍵信號通路的分析表明,應用的靜水壓力導致OA相關通路MAPK / ERK和PI3K / Akt的激活增強。


在這項研究中,據我們所知,我們首先證明由定制的靜水壓力系統誘導的無細胞超氧化物形成為軟骨形成的MSC顆粒產生退化的OA樣環境。



Materials and Methods  材料和方法




如果沒有另外說明,所有化學品和試劑均購自Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)並且是分析級的。



人類脂肪組織衍生的基質細胞(hASC)由Ludwig Boltzmann實驗和臨床創傷學研究所與上奧地利州的紅十字會血液轉運服務機構合作提供。 根據Wolbank 等人描述的相關指南和法規進行細胞分離。 24經當地倫理委員會(上奧地利州省)授權並獲得捐助者的知情同意。 簡而言之,通過用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)對脂肪抽吸物進行幾次洗滌步驟,然後酶消化組織,獲得基質血管部分。 隨後,將細胞級分接種在塑料盤上,允許在塑料粘附細胞和非粘附細胞之間進行選擇。 根據實驗室特定的標準操作程序(SOP),進一步培養和冷凍塑料粘附的hASC。


為了擴增,將hASC在DMEM:F12(Lonza,Basel,Switzerland)中培養,補充有10%胎牛血清(FBS; GE Healthcare,Little Chalfont,United Kingdom),100U / mL青黴素,100μg/ mL鏈黴素(1) %P / S; Lonza,Basel,Switzerland)和5ng / mL鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF; PeproTech,Rocky Hill,NJ,USA)。 該介質將進一步稱為膨脹介質(EM)。 將細胞在標準細胞培養皿(STARLAB,Hamburg,Germany)上在37℃和5%CO 2的潮濕培養箱中擴增。 為了避免過早分化,將細胞以80-85%匯合進行傳代培養。 當達到所需的細胞濃度時,將hASC轉移到圓底96孔板(SPL Life Sciences,Korea)中並以300×g離心5分鐘以形成細胞沉澱。 每個孔含有2.5×10 5個細胞,離心後3天內完全形成沉澱。 用補充有2mM L-谷氨酰胺(Lonza,Basel,Switzerland),1%P / S(Lonza,Basel,Switzerland),1mM丙酮酸鈉,10mM HEPES,50的DMEM(Lonza,Basel,Switzerland)分析顆粒。 μg/ mL脯氨酸,1x胰島素 - 轉鐵蛋白 - 亞硒酸鈉(ITS + 3),100 nM地塞米松(DEX),170μM抗壞血酸(AA),10 ng / mL轉化生長因子-β3(TGF-β3; PeproTech, Rocky Hill,NJ,USA)和10ng / mL骨形態發生蛋白6(BMP-6; PeproTech,Rocky Hill,NJ,USA)共42天。 該培養基將進一步稱為分化培養基(DM)。 在第2天進行部分培養基更換,然後每3-4天更換一次培養基,直到實驗結束。



定制靜水壓力系統




壓力室(圖1A )由銑削鋁基板組成,適用於6至96孔的任何類型的多孔板。 壓力通過該底板壁內的入口衝入內腔。 對於均勻的空氣和相等的壓力分佈,每側配備2個入口,總共最多8個入口。 用丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯(ABS)蓋板封閉壓力室(圖1B )。 蓋板在頂側具有6個出口端口,這些出口端口規則地分佈以允許均勻的排氣。 為了提供氣密密封,壓力室在腔室的兩個部件之間具有O形環密封。 ABS蓋板用12個不銹鋼螺釘固定。





靜水壓力生物反應器系統。 ( A )壓力室的鋁基板,總共有8個入口(每側2個入口),以便在室內均勻地分配空氣和壓力。 底板在96孔板中容納沉澱培養物(每孔填充250μL培養基1個沉澱)。 ( B )壓力室用ABS蓋板封閉,蓋板頂部共有6個出口,可快速均勻地排氣。 蓋板用12個不銹鋼螺釘固定在底板上,O形密封圈提供氣密密封。 ( C )定制生物反應器系統的示意圖:培養箱(i)提供CO 2緩衝空氣,其可在壓縮機(ii)中加壓至8巴並且被送至加濕器(iv)。 集成了背壓閥(iii)以僅允許單向流到加濕器。 然後將潤濕的空氣引入壓力室(vi),並通過入口(v)和出口(vii)電磁閥控制最大壓力值以及計劃的狀態。 壓力室包含受刺激的顆粒,可容納任何標準孔板形式(96至6孔板)。 用壓力傳感器(viii)測量腔室中的壓力,並在μController(ix)中處理測量值,μController(ix)根據用戶通過GUI / PC(x)設置的方案控制兩個電磁閥。 ( D )刺激顆粒所必需的組裝生物反應器系統。 將加濕器和壓力室置於水浴中以保持介質溫度恆定在37℃。




通過兩個電磁閥(Bürkert,Ingelfingen,德國)調節壓力,一個在入口之前,一個在室的入口之後(圖1C )。 閥門由微控制器(Microchip Technology Inc.,Chandler,AZ,USA)控制,運行以C編碼的定製程序。用戶通過使用Visual Studio C#編碼的圖形用戶界面(GUI)訪問微控制器(Microsoft,雷德蒙德,華盛頓州,美國)。 該程序專門設計用於使用戶能夠定義關鍵實驗參數,如壓力,循環時間和總刺激週期。 此外,GUI實時顯示壓力,該壓力由連接到壓力室的壓力傳感器(RS Components,Corby,UK)測量。


壓力由市售的空氣冷卻氣體壓縮機(Jun-Air,Redditch,UK)產生(圖1D ),其從培養箱吸入空氣並將其壓縮至8巴的最大壓力。 空氣在定制的加濕器中保濕,以防止壓力室內的孔中的介質蒸發。 通過壓力室後,空氣被轉移回培養箱,關閉環路。



實驗計劃和機械刺激協議



將hASC培養2-3週直至達到所需的細胞濃度。 然後,收穫細胞並離心以形成顆粒。 收穫和造粒的日期定義為實驗的第0天。 將顆粒分成3個實驗組(無刺激,HP刺激,21天無刺激,隨後HP刺激21天)(圖2A )並培養至第42天,每7天收集樣品。 所有實驗組在整個實驗期間經歷DM。





實驗研究設置。 ( A )將人ASCs培養2-3週直至達到所需的細胞濃度。 然後,將每個沉澱物250,000個細胞離心以誘導沉澱形成,其在3天內完成。 將顆粒分成3組:未刺激的靜態對照42天(nHP),靜水壓力刺激(HP)42天,21天無刺激,隨後HP刺激21天(nHP→HP)。 在第0天,第3天和第7天以及從第七天開始在實驗的總時間段內收穫小丸。 ( B )靜水壓力刺激方案。 在初始顆粒形成3天后,將顆粒以2秒開/關方式進行4小時的間歇刺激,最大和最小壓力分別為4和0巴。 
每個刺激階段之後是20小時的無壓力期。 該方案每周連續5天重複,中間休息2天。 重複該模式直至第42天的實驗結束。
聯繫專人Wechat&Line:Tim 0939266913 


HP刺激的顆粒以2秒的開/關方式進行4小時的間歇刺激,最大和最小壓力分別為4和0巴。 每個刺激階段之後是20小時的無壓力期。 每周連續5天重複該方案。 重複該模式直至第42天的實驗結束(圖2B )。



組織學和免疫組化(IHC)分析



將收穫的沉澱培養物在4%甲醛(Histofix,Roth,Karlsruhe,Germany)中於4℃固定24小時,並用分級系列的乙醇步驟(50%至100%)脫水。 將樣品包埋在石蠟中,切成5μm,並安裝在載玻片上。 為了進行不同的染色,將切片用二甲苯(Roth,Karlsruhe,Germany)脫石蠟,並用分級系列的乙醇洗滌液再水化成蒸餾水。 通過阿爾新藍染色檢測糖胺聚醣(GAG)。 簡言之,通過Alcian blue 8GX(Sigma,St.Louis,MO,USA)進行阿爾新藍染色30分鐘,然後用蒸餾水沖洗直至切片清潔。 然後,將載玻片用Mayers Hemalum(Roth,Karlsruhe,Germany)複染2分鐘,並在流動的自來水中沖洗10分鐘。 然後,將切片用分級系列的乙醇洗滌液脫水,用二甲苯(Roth,Karlsruhe,Germany)清洗並用載玻片覆蓋。

通過IHC染色檢測I型和II型膠原蛋白,以評估顆粒培養物的軟骨組織形成的質量。 簡而言之,通過在40℃下將石蠟包被的樣品乾燥過夜進行I型膠原染色,同時將膠原II型染色在60℃下乾燥30分鐘。 然後將樣品脫石蠟並用3%H 2 O 2 (Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)封閉內源性過氧化物酶10分鐘並用蒸餾水沖洗。 將載玻片在檸檬酸三鈉緩衝液(pH6.0)(ZUC028-500,Zytomed,Berlin,Germany)中蒸發20分鐘用於I型膠原蛋白或用胃蛋白酶溶液(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)在37℃處理10分鐘。對於II型膠原,然後用Tris緩衝鹽水(TBS)沖洗5分鐘。 將樣品在馬血清(S-2012,Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)中孵育20分鐘,與第一抗體(兔多克隆抗膠原蛋白1(Abcam,Cambridge,United Kingdom))孵育;小鼠單克隆抗膠原蛋白2(MS-306-PO,Thermo Fisher,Waltham,MA,USA))在室溫(RT)下1小時,用TBS沖洗5分鐘並與第二抗體(I型膠原:山羊抗兔過氧化物酶)一起孵育標記為IG(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA); II型膠原:山羊抗小鼠過氧化物酶標記的IG(K4001,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA))在室溫下30分鐘,然後用TBS漂洗持續5分鐘 為了檢測,將切片與2-3滴VECTOR NovaRED(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)一起溫育3分鐘,並通過浸沒在水中10分鐘來終止反應。 然後,將載玻片用Hemalum(Roth,Karlsruhe,Germany)複染1分鐘並在自來水中變藍10分鐘。 將載玻片脫水,用二甲苯(Roth,Karlsruhe,Germany)清洗並用載玻片覆蓋。


通過電子順磁共振(EPR)測量確定活性氧(ROS)


將分化培養基與500μM旋轉探針環羥胺1-羥基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷鹽酸鹽(CP-H; Noxygen,Elzach,Germany)在刺激下孵育4小時(4巴) ,2 s / 2 s模式)或靜態條件下。 另外,為了進一步闡明其潛在機制,將鐵螯合劑二乙烯三胺五乙酸(DTPA),超氧化物歧化酶(SOD)或DTPA和SOD兩者加入到培養基中。 為了分析,將培養基置於100mL的1mL一次性移液管(VWR International,Radnor,PA,USA)中並在液氮中快速冷凍。 使用Magnettech MiniScope MS 200 EPR光譜儀(Magnettech Ltd.,Berlin,Germany)在3359±200G下記錄冷凍樣品的EPR光譜25 。 一般設置如下:調製頻率100kHz,微波頻率9.425GHz,微波功率11mW,調製幅度7G。 計算氧化的CP-H(3-CP)信號的大小並以任意單位(AU)表示。



定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)



通過在組織勻漿器(Precellys®24; Bertin corp。,Rockville,MD,USA)中用組織研磨珠(Bertin corp。,Rockville,MD,USA)切碎粒料,在第0,21和42天收穫細胞,隨後通過使用peqGOLD總RNA試劑盒(VWR International,Radnor,PA,USA)進行總mRNA提取。 使用NanoPhotometer(Implen GmbH,München,Germany)測量RNA,並使用oligo(dT)引物,使用EasyScript TM cDNA合成試劑盒(abm,Richmond,BC,Canada)將1μgmRNA轉錄成cDNA。 使用KAPASYBR®FASTqPCR試劑盒(VWR International,Radnor,PA,USA)和Stratagene©Mx3000P QPCR系統(Agilent,Santa Clara,CA,USA),根據製造商的說明書,使用每個反應10ng cDNA進行定量PCR。 。 熱循環條件是在95℃下5分鐘,然後是在95℃下10秒和在60℃下30秒(B2M,MMP3,RUNX2,IL6)或在95℃下30秒和在60℃下1分鐘的40個循環。 C(ACAN,COL1A1,COL2A1,COL10A1,SOX9,MMP9,MMP13,IL-1β,IL-6,TNF-α。 對於時間依賴性表達譜,將靶基因標準化為管家β2-微球蛋白(B2M),並使用比較CT(ΔΔCT)方法與第0天的相應值進行比較。 使用的引物序列列於表1中 。


表1用於qPCR的引物序列。




矩陣組件的量化

進行生化測定以定量GAG和DNA含量。 因此,將沉澱物在液氮中快速冷凍並用500μL蛋白酶K溶液(≥30單位/ mL蛋白酶K,50mM TRIS,1mM EDTA,1mM碘乙酰胺,10μg/ mL胃蛋白酶抑製劑A在ddH 2 O中)消化。在56°C過夜。


GAG量化




使用基於二甲基亞甲基藍(DMMB)的染色測定法測定沉澱培養物的GAG含量。 簡言之,將5μL蛋白酶K消化的樣品用95μL磷酸鹽緩衝的EDTA(100mM Na 2 HPO 4和10mM EDTA的PBS溶液)在平底96孔板中稀釋,並用軟骨素-4稀釋系列稀釋。製備1.75mg / mL半胱氨酸的硫酸鹽作為標準。 將100μL稀釋的樣品或標準物與200μLDMMB溶液(38.5μMDMMB,1%EtOH,40.5mM NaCl,40.5mM甘氨酸和9.5mM乙酸在ddH 2 O中)混合,並測量樣品的吸光度。使用讀板器(Sunrise Basic; Tecan Trading AG,Männedorf,Switzerland)將540nm對595nm作為參考波長。



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DNA定量




使用QuantiFluor®dsDNA試劑盒(E2670; Promega,Madison,WI,USA)定量沉澱中存在的DNA。 簡言之,將5μL蛋白酶K消化的樣品用95μL1Xtris-EDTA(TE)緩衝液在黑色平底96孔板中稀釋,並使用提供的Lambda DNA Standard產生標準曲線。 將樣品和標準品與100μL1XQuantiFluor®dsDNA染料混合,並在室溫(RT)下在黑暗中孵育5分鐘,然後使用GloMax進行熒光測量(藍色熒光光學試劑盒; 490 nm Ex / 510-570 nm Em )進行了®-Multi +檢測系統(Promega,Madison,WI,USA)。



生存能力評估




使用標準甲基噻唑基二苯基 - 四唑溴化物(MTT)方法,通過比色測定評估沉澱中的細胞活力。 因此,將顆粒刺激4小時(4巴,2秒/ 2秒模式)或在靜態條件下培養。 將沉澱物轉移到48孔板中並與500μLMTT工作溶液(650mg / mL MTT在ddH 2 O中)一起溫育2小時。 棄去MTT工作溶液並將生成的甲in溶解在500μlDMSO中1小時。 使用平板讀數器在540nm波長對650nm處測量吸光度作為參考波長。



蛋白質印跡




將PBS洗滌的顆粒在液氮中快速冷凍並用鑷子粉碎成粉末。 將粉末在Nonidet P-40緩衝液中重建,該緩衝液含有40mM HEPES(pH 7.9),120mM NaCl,1mM EDTA(pH 8.0),10mM 2-甘油磷酸鹽,50mM NaF,0.5mM Na 3 VSO 4,1 % Nonidet P-40替代品和1mM苯基 - 甲基 - 磺酰氟(PMSF),補充2μg/ mL抑肽酶,2μg/ mL亮肽素,0.3μg/ mL苯甲脒氯化物和10μg/ mL胰蛋白酶抑製劑並裂解。 通過幾次冷凍和解凍循環提取顆粒的總蛋白質。 將蛋白質提取物在冰上溫育1小時,並在4℃下以22,000×g離心20分鐘。 收集每個樣品的上清液,轉移到新的小瓶中,並使用Bradford測定法(Protein Assay Dye Reagent Concentrate; Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在NanoPhotometer(Implen GmbH,Munich,Germany)上測定蛋白質濃度。製造商的說明。 在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10%運行凝膠和5%堆積凝膠)上向每個泳道施加等量的蛋白質(10μg/泳道)並在增加的電壓(60,80,100V)下運行。 然後,將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(GE Healthcare,Little Chalfont,United Kingdom)上,並用含有0.1%吐溫(TBS / T)的TBS緩衝液中的5%脫脂奶粉封閉。 將一抗在4℃下在5%BSA的TBS / T中孵育過夜,並將二抗在室溫下在TBS / T中的5%脫脂奶粉中孵育1小時。 使用Odyssey Fc成像系統(LI-COR,Lincoln,NE,USA)檢測信號,並用Image Studio Lite(LI-COR,Lincoln,NE,USA)評估,以產生磷酸化蛋白質與總蛋白質或管家的比率。 。 磷酸-AKT(Ser-473),總AKT,磷酸-p44 / 42 MAPK(Thr-202 / Tyr-204)(磷酸-Erk1 / 2),總p44 / 42 MAPK(總ERK1 / 2),磷酸化合物的抗體-p38 MAPK(Thr-180 / Tyr-182),總p38 MAPK,磷酸-S6核醣體蛋白(Ser-240/244),總S6核醣體蛋白,β-連環蛋白和GAPDH獲自Cell Signaling Technology(Danvers, MA,USA)。 第二抗體IRDye®680RD山羊抗小鼠IgG,IRDye®680LT驢抗兔IgG,IRDye®800CW山羊抗小鼠IgG和IRDye®800CW山羊抗兔IgG獲自LI-COR Biosciences(Lincoln,NE) , 美國)。



統計分析




除非另有說明,否則所有數據均表示為平均值+標準偏差(SD)。 使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)進行所有統計學計算。 使用D'Agostino-Pearson綜合測試測試值的正態分佈。 使用Mann-Whitney U檢驗或單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較檢驗或Kruskal-Wallis檢驗和Dunn多重比較檢驗分別計算兩組或多組之間的比較。 P值 <0.05被認為具有統計學意義。



2018年12月16日 星期日

規範基因治療革命


20181212

醫療監管機構為基因治療進行了一波臨床研究。



圖片來源:Sam Falconer
For rare genetic diseases that affect the young, such as a neurodegenerative condition called spinal muscular atrophy, gene therapies bring much-needed hope — a chance for the child to live a relatively normal life. But they also raise serious fears about their efficacy and the potential risks that accompany irreversible one-off treatments.


對於影響年輕人的罕見遺傳疾病,例如稱為脊髓性肌萎縮的神經退行性疾 病,基因療法帶來了急需的希望 - 讓孩子過上相對正常的生活。 但他們也對其功效以及伴隨不可逆轉的一次性治療帶來的潛在風險表示嚴重擔憂。

自然觀的一部分:基因療法
平衡這些希望和恐懼的責任在於歐洲藥品管理局(EMA)和美國食品和藥物管理局(FDA)。 他們作為治療守門人的資格很快將通過大量臨床試驗進行測試。 FDA專員斯科特·戈特利布(Scott Gottlieb)表示,今年美國食品和藥物管理局預計將接受約250項申請,開始進行新細胞和基因治療的臨床試驗。
面對生物學理解和治療傳遞技術的快速進步,這兩個監管機構正在為臨床試驗制定新的指南,並準備就哪些藥物批准進行營銷做出艱難的決定。 但憑藉他們在數百項早期研究中的經驗,這些機構相信他們可以像對待任何其他新療法一樣有效地評估基因療法。
規範安全

基因治療長期以來一直受到極少數死亡的困擾,最初是在1999年的美國臨床試驗中,然後在幾年後的歐洲研究中。 然而,過去十年中一系列成功的臨床試驗為這些治療方法的進展創造了足夠的信心。
201712月的一個里程碑是FDA批准的體內基因治療產品,來自賓夕法尼亞州費城的Spark TherapeuticsLuxturna Luxturna治療由一種名為RPE65的基因突變引起的罕見的遺傳性眼病,該基因可導致失明。
另一個是20188月宣布,在臨床研究開始之前,美國國立衛生研究院(NIH)重組DNA諮詢委員會在遺傳醫學誕生之初就已開始進行臨床研究,因此不再需要對基因療法進行審查。 Gottlieb和美國國立衛生研究院院長弗朗西斯柯林斯在一篇論文中寫道:現在已經沒有足夠的證據表明基因治療的風險是完全獨特和不可預測的 - 或者該領域仍然需要特殊的監督,而這種監督不屬於我們現有的確保安全的框架。今年早些時候發表( FS CollinsS.Gottlieb N.Engl.J.Med.379,1393-1395; 2018 )。
即便如此,這類新藥仍然存在嚴重風險。 “並不是人們會說:'哦,這一切都很安全,不要擔心'血液學家兼Spark主席Katherine High說。 “現在我們真的有一些參數,我們可以在其中工作。

外科醫生使用Luxturna,這是美國食品和藥物管理局批准的首個體內基因療法,用於治療患有遺傳性眼病的男孩。 圖片來源:Ed Shipman /馬薩諸塞州的眼睛和耳朵



她指出,例如,先前的試驗已經收集了大量關於通過腺相關病毒(AAV)傳遞的Luxturna等療法的證據,特別是對於全身給藥或眼睛等常見靶向組織。這種AAV療法通常在肝臟中產生短期免疫應答,但是這個問題通常可以通過使用類固醇來治療。 “對於其他目標組織,或者高於人們迄今為止使用過的劑量,您可能需要額外的信息,”High說。 “實際上有很多方法可以克服免疫反應,這是進行臨床研究和尋找答案的問題。

蓋恩斯維爾佛羅里達大學鮑威爾基因治療中心主任Barry Byrne表示,現在宣布今天的基因治療安全還為時尚早。 “他的經驗非常有限,他警告說,還有很多工作要做,以了解如何在各種條件下使用它們。

有許多未解決的問題,例如,如果接受AAV提供的基因療法的患者之前曾暴露於某種形式的病毒,或者基因療法產生的蛋白質因為免疫系統尚未接受過培訓而引發反應,會發生什麼? Byrne補充說,將它們視為'自我' 但他認為,正在出現避免或控制此類免疫問題的策略。

當進入臨床研究時,新形式的基因療法遞送和作用機制有時不能達到預期的效果。 20189月,總部位於加利福尼亞州里士滿的Sangamo Therapeutics報告了人體內第一次基因編輯試驗的初步結果,該療法用於治療罕見的代謝性疾病,稱為亨特綜合徵。 該疾病主要影響男性,引起許多嚴重症狀,目前治療需要每週注射一次酶。 但最初的Sangamo試驗未能證明臨床獲益,現在他們繼續服用更高的劑量。





監管機構正在尋求為這些新興的基因編輯療法提供更多指導。 EMA高級醫療官員Hans-Georg Eichler表示,EMAFDA正在共同努力以避免我們兩人之間的分歧 “在一般的基因治療中,我們喜歡相信我們知道主要風險是什麼,但你永遠不會知道,艾希勒說。 “明天,一些全新的東西可能會突然出現。 但這並不是說患者不應該接受基因治療。

更好的設計

鑑於基因療法的新穎性和潛在的風險和回報,他們的讚助商傾向於在開發早期就開始與監管機構合作 - 通常很早。 “理想情況下,當你設計臨床前開發時,你會與代理商交談,馬薩諸塞州劍橋市生物技術公司Bluebird Bio的監管副總裁Anne-Virginie Eggimann說。 “您可以與他們就設計該計劃進行一般性討論,以及您如何看待您的首次人體臨床試驗。”10月,Bluebird BioEMA提交了針對其LentiGlobin基因療法的營銷申請,旨在治療一種稱為輸血依賴性β-地中海貧血的罕見血液病。

LentiGlobin一樣,提交給FDA的基因治療研究新藥(IND)申請中約有70%用於治療罕見疾病。 大多數這些病症首先出現在兒童時期,其中大多數具有毀滅性的結果。 但是,通常不可能進行包括大量受試者和對照組的正常臨床試驗。

我們知道在這些情況下你必須要有一定的靈活性,這正是我們通常在公司早期討論時所討論的,艾希勒說。 “我們進行談判,看看我們如何能夠在這種情況下獲得最好的效果。
鑑於許多罕見的遺傳性疾病襲擊兒童的破壞性,父母經常要求加速臨床試驗。 但開發商強調降低安全標準不是一種選擇。 “我真的理解孩子患有嚴重疾病的父母的緊迫感,高說。 “另一方面,這是一個你不能有兩個安全標準的領域。

試驗贊助商和監管機構也擔心候選產品的製造方式,以及產品如何隨著時間的推移而受到製造過程變化的影響。 使用生物材料製作基因療法是一個非常複雜的過程,每一步都必須確保極高的質量。 大多數學術實驗室和生物技術創業公司缺乏足夠的專業知識和設備,足以在商業規模上生產商業級療法。目前很少有生物製造設施提供這樣的服務,並且這些操作因目前臨床試驗的治療數量而過載。 隨著試驗的進展,需要改善製造工藝,同時保持產品的一致性以保持監管機構的滿意度,這些困難更加複雜。


製造業是我們必須以不同的方式思考的問題,因此我們可以在第一時間做到正確,負責基因治療的馬里蘭州Silver Spring生物製品評估與研究中心主任彼得馬克斯說。

英國政府商業孵化器細胞與基因療法彈射器首席臨床官員杰奎琳巴里說:人們常常在實驗室工作台上進行小規模的開發,他們需要擴大規模,擴大思路。” “我們很早就嘗試與他們合作,轉向一個良好的製造過程,並收集數據,支持臨床試驗階段之間產品的發展,而無需回頭重做研究。




基因療法還需要對產品批准延長多年的患者進行隨訪,因為這些一次性治療的長期影響根本不為人所知。 “臨床醫生必須抓住這個想法,艾希勒說。在我們對待時,我們必須確定患者的經歷 - 無論好壞 - 必須以某種方式反饋給決策者,並為長期知識的產生做出貢獻。

尋求批准

歐洲和美國在批准基因療法方面有著截然不同的法律和監管制度。 主要區別在於FDA負責監督臨床試驗,而EMA則沒有。 為了在歐盟的28個成員中進行臨床試驗,你必須得到主管當局和該成員國倫理委員會的批准,巴里說。您還必須獲得使用轉基因生物(GMO)的批准。 然而,臨床試驗指令和GMO指令在每個國家的翻譯略有不同,她指出。

此外,在歐洲和美國,參與決策的結構不同,Eggimann說。 EMA,來自各州的委員會成員會面以做出有關營銷批准的決定。 FDA,相應部門的審核人員在整個生命週期中都會跟踪候選藥物。

但是這兩個機構採用類似的數據驅動方法來評估藥物安全性和有效性,通常在這個過程中積極合作。 例如,他們每年都會舉行幾次基因療法的電話會議。 “我們都知道這個領域存在很多不確定因素,而且我們希望彼此保持這麼多新的發展,艾希勒說。

兩家機構都在2018年發布了基因治療指南的重大更新。例如,FDA根據疾病類別提出了初步建議草案,從血友病,視網膜疾病和罕見疾病開始。 它還為某些製造流程和長期患者隨訪要求添加了框架草案。 EMA還徹底改革了其基因治療框架。 例如,它重新設計了關於交付機制的設計,製造,表徵和測試的指導。

隨著該領域獲得越來越多的經驗,需要提交以開展臨床研究的內容的大致輪廓更明確地成為焦點,”High說。 “你發現這些反映在FDAEMA提供的指導文件中。
基因治療開發人員擔心這些機構缺乏足夠的專家來處理細胞和基因治療的新浪潮,FDA估計到2021年每年將達到1000例。他們沒有足夠的人來處理這種工作量,高說。
對於FDA來說,問題始終圍繞著預算,並且能夠擁有適當的技術和人員來履行他們的承諾,位於康涅狄格州丹伯里的全國罕見疾病組織總裁Peter Saltonstall說。

基因治療仍處於早期階段,但到目前為止,開發人員通常會將這兩個機構視為合作夥伴。 “我根本沒有把這些機構視為障礙,拜恩說。 “他們現在擁有如此多的與讚助商互動的機制,他們總是與讚助商聯繫,以推動這些代理商的發展。

Eggimann同意。 “監管機構一直非常支持創新和基因治療,他們非常渴望學習,她說。 “我們的挑戰來自科學的新穎性,而不是來自監管方面。

同時,治療方法繼續向前發展。 其中包括AVXS-101,一種來自伊利諾斯州BannockburnAveXis的基因療法。 AVXS-101在治療脊髓性肌萎縮的早期臨床試驗中寄予厚望,這是一種影響兒童的破壞性神經退行性疾 病。 201810月,AveXisFDAEMA申請上市 - 這是基因治療從實驗室到診所的另一個橋樑。

資料來源:https://translate.google.com/translate?hl=zh-TW&sl=en&u=https://www.nature.com/articles/d41586-018-07641-1&prev=search