Abstract 概要
Hydrostatic pressure-generated reactive oxygen species induce osteoarthritic conditions in cartilage pellet cultures
Osteoarthritis (OA) is one of the most common causes of disability and represents a major socio-economic burden. Despite intensive research, the molecular mechanisms responsible for the initiation and progression of OA remain inconclusive. In recent years experimental findings revealed elevated levels of reactive oxygen species (ROS) as a major factor contributing to the onset and progression of OA. Hence, we designed a hydrostatic pressure bioreactor system that is capable of stimulating cartilage cell cultures with elevated ROS levels. Increased ROS levels in the media did not only lead to an inhibition of glycosaminoglycans and collagen II formation but also to a reduction of already formed glycosaminoglycans and collagen II in chondrogenic mesenchymal stem cell pellet cultures. These effects were associated with the elevated activity of matrix metalloproteinases as well as the increased expression of several inflammatory cytokines. ROS activated different signaling pathways including PI3K/Akt and MAPK/ERK which are known to be involved in OA initiation and progression. Utilizing the presented bioreactor system, an OA in vitro model based on the generation of ROS was developed that enables the further investigation of ROS effects on cartilage degradation but can also be used as a versatile tool for anti-oxidative drug testing.
骨關節炎（OA）是導致殘疾的最常見原因之一，並且是主要的社會經濟負擔。 儘管進行了深入研究，但是負責OA起始和進展的分子機制尚無定論。 近年來，實驗結果顯示活性氧（ROS）水平升高是導致OA發生和發展的主要因素。 因此，我們設計了一種靜水壓力生物反應器系統，能夠刺激具有升高的ROS水平的軟骨細胞培養物。 培養基中ROS水平的增加不僅導致糖胺聚醣和膠原蛋白II形成的抑制，而且還導致軟骨形成間充質乾細胞沉澱培養物中已形成的糖胺聚醣和膠原蛋白II的減少。 這些作用與基質金屬蛋白酶的活性升高以及幾種炎性細胞因子的表達增加有關。 ROS激活不同的信號傳導途徑，包括已知參與OA起始和進展的PI3K / Akt和MAPK / ERK。 利用所提出的生物反應器系統，開發了基於ROS產生的OA 體外模型，其能夠進一步研究ROS對軟骨降解的影響，但也可以用作抗氧化藥物測試的通用工具。
Introduction 介紹
骨關節炎（OA）是最常見的關節炎類型，影響25％的成年人群。 據預測，僅在美國，到2020年將有大約5000萬人患OA. 1,2 。 這種退行性關節病主要在老年人中觀察到，這在歷史上導致OA是一種簡單的關節軟骨“磨損”疾病的假設3,4 。 據信，關節軟骨的損失隨後導致生物力學改變與細胞變化相結合，隨著時間的推移導致軟骨下骨，滑膜，半月板，韌帶，關節周圍肌肉和神經的嚴重變化5 。 該假設由體內模型的結果支持，其中例如通過橫切前十字韌帶6,7來誘導膝關節的機械不穩定性以促進軟骨結構的過度磨損。
近來，OA越來越多地被認為是引起關節軟骨細胞穩態失衡的炎症過程，最終導致關節軟骨的進行性喪失和破壞。 與類風濕性關節炎（RA）類似，OA與滑膜炎症相關，但通常程度較小（滑液白細胞數量少於RA）。 相反，OA的特徵在於高水平的許多促炎細胞因子和趨化因子，其導致產生細胞外基質降解酶，例如負責關節軟骨損失的基質金屬蛋白酶（MMP） 5 。
儘管進行了20多年的研究，但是對OA起始和進展負責的分子機制仍然知之甚少。 然而，現在人們普遍認為，OA的發病機制遠比“磨損”複雜得多，並且過度和異常關節負荷形式的機械因素起著至關重要的作用。
在這方面，已經建立了不同的體內和體外 OA模型來破譯導致該疾病的特定因子的作用。
大多數體外 OA模型使用軟骨外植體，原代（骨關節炎）軟骨細胞或間充質乾細胞（MSC）分化成軟骨細胞譜系，並且可以根據分解代謝過程開始時使用的觸發進行分組。 大多數研究涉及單獨使用細胞因子治療（如添加促炎細胞因子IL-1β或TNF-α）或與物理刺激相結合，如滲透壓，物理損傷/變形和機械加載方式。 8,9,10 。 在這方面，已顯示循環流體靜壓增加一氧化氮的產生以及蛋白多醣合成11和改變IL-1β處理的骨關節炎軟骨細胞的細胞超微結構12,13 。 這些發現強調了機械刺激對於不僅健康而且還有骨關節炎軟骨細胞的止血的重要性。
在過去的十年中，許多研究表明活性氧（ROS）參與OA的發生和發展[ 14,15] 。 到目前為止，只有少數研究使用適當的生理體外模型來模擬升高的ROS水平以產生OA模型。 在選擇的研究中，通過應用H 2 O 2 16,17,18,19,20產生骨關節炎軟骨細胞，其基於嗜中性粒細胞和巨噬細胞或軟骨細胞自身在發炎的膝關節中體內產生H 2 O 2 。 在這方面，已經顯示軟骨細胞通過激活NADPH氧化酶（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶） 21產生超氧自由基，其隨後可以分解成H 2 O 2 。 此外，Regan 等人 。 研究表明，與來自健康患者的樣本相比，OA患者的關節液的特徵是細胞外超氧化物歧化酶（SOD）水平顯著降低[ 22,23] ，表明不受控制的超氧化物水平在OA起始中起關鍵作用。
在這裡，我們證明通過壓縮空氣施加靜水壓力（HP）誘導產生高水平的超氧化物和其他ROS物質（通過電子順磁共振測量確定），其隨後通過下調軟骨表達阻礙MSC顆粒培養物的軟骨形成發育。 - 特異性蛋白質，例如II型膠原蛋白和糖胺聚醣，以及上調I型膠原蛋白，基質金屬蛋白酶和炎性細胞因子的表達。 此外，關鍵信號通路的分析表明，應用的靜水壓力導致OA相關通路MAPK / ERK和PI3K / Akt的激活增強。
在這項研究中，據我們所知，我們首先證明由定制的靜水壓力系統誘導的無細胞超氧化物形成為軟骨形成的MSC顆粒產生退化的OA樣環境。
Materials and Methods 材料和方法
如果沒有另外說明，所有化學品和試劑均購自Sigma Aldrich（St.Louis，MO，USA）並且是分析級的。
人類脂肪組織衍生的基質細胞（hASC）由Ludwig Boltzmann實驗和臨床創傷學研究所與上奧地利州的紅十字會血液轉運服務機構合作提供。 根據Wolbank 等人描述的相關指南和法規進行細胞分離。 24經當地倫理委員會（上奧地利州省）授權並獲得捐助者的知情同意。 簡而言之，通過用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）對脂肪抽吸物進行幾次洗滌步驟，然後酶消化組織，獲得基質血管部分。 隨後，將細胞級分接種在塑料盤上，允許在塑料粘附細胞和非粘附細胞之間進行選擇。 根據實驗室特定的標準操作程序（SOP），進一步培養和冷凍塑料粘附的hASC。
為了擴增，將hASC在DMEM：F12（Lonza，Basel，Switzerland）中培養，補充有10％胎牛血清（FBS; GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom），100U / mL青黴素，100μg/ mL鏈黴素（1） ％P / S; Lonza，Basel，Switzerland）和5ng / mL鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF; PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）。 該介質將進一步稱為膨脹介質（EM）。 將細胞在標準細胞培養皿（STARLAB，Hamburg，Germany）上在37℃和5％CO 2的潮濕培養箱中擴增。 為了避免過早分化，將細胞以80-85％匯合進行傳代培養。 當達到所需的細胞濃度時，將hASC轉移到圓底96孔板（SPL Life Sciences，Korea）中並以300×g離心5分鐘以形成細胞沉澱。 每個孔含有2.5×10 5個細胞，離心後3天內完全形成沉澱。 用補充有2mM L-谷氨酰胺（Lonza，Basel，Switzerland），1％P / S（Lonza，Basel，Switzerland），1mM丙酮酸鈉，10mM HEPES，50的DMEM（Lonza，Basel，Switzerland）分析顆粒。 μg/ mL脯氨酸，1x胰島素 - 轉鐵蛋白 - 亞硒酸鈉（ITS + 3），100 nM地塞米松（DEX），170μM抗壞血酸（AA），10 ng / mL轉化生長因子-β3（TGF-β3; PeproTech， Rocky Hill，NJ，USA）和10ng / mL骨形態發生蛋白6（BMP-6; PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）共42天。 該培養基將進一步稱為分化培養基（DM）。 在第2天進行部分培養基更換，然後每3-4天更換一次培養基，直到實驗結束。
定制靜水壓力系統
壓力室（圖1A ）由銑削鋁基板組成，適用於6至96孔的任何類型的多孔板。 壓力通過該底板壁內的入口衝入內腔。 對於均勻的空氣和相等的壓力分佈，每側配備2個入口，總共最多8個入口。 用丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯（ABS）蓋板封閉壓力室（圖1B ）。 蓋板在頂側具有6個出口端口，這些出口端口規則地分佈以允許均勻的排氣。 為了提供氣密密封，壓力室在腔室的兩個部件之間具有O形環密封。 ABS蓋板用12個不銹鋼螺釘固定。
靜水壓力生物反應器系統。 （ A ）壓力室的鋁基板，總共有8個入口（每側2個入口），以便在室內均勻地分配空氣和壓力。 底板在96孔板中容納沉澱培養物（每孔填充250μL培養基1個沉澱）。 （ B ）壓力室用ABS蓋板封閉，蓋板頂部共有6個出口，可快速均勻地排氣。 蓋板用12個不銹鋼螺釘固定在底板上，O形密封圈提供氣密密封。 （ C ）定制生物反應器系統的示意圖：培養箱（i）提供CO 2緩衝空氣，其可在壓縮機（ii）中加壓至8巴並且被送至加濕器（iv）。 集成了背壓閥（iii）以僅允許單向流到加濕器。 然後將潤濕的空氣引入壓力室（vi），並通過入口（v）和出口（vii）電磁閥控制最大壓力值以及計劃的狀態。 壓力室包含受刺激的顆粒，可容納任何標準孔板形式（96至6孔板）。 用壓力傳感器（viii）測量腔室中的壓力，並在μController（ix）中處理測量值，μController（ix）根據用戶通過GUI / PC（x）設置的方案控制兩個電磁閥。 （ D ）刺激顆粒所必需的組裝生物反應器系統。 將加濕器和壓力室置於水浴中以保持介質溫度恆定在37℃。
通過兩個電磁閥（Bürkert，Ingelfingen，德國）調節壓力，一個在入口之前，一個在室的入口之後（圖1C ）。 閥門由微控制器（Microchip Technology Inc.，Chandler，AZ，USA）控制，運行以C編碼的定製程序。用戶通過使用Visual Studio C＃編碼的圖形用戶界面（GUI）訪問微控制器（Microsoft，雷德蒙德，華盛頓州，美國）。 該程序專門設計用於使用戶能夠定義關鍵實驗參數，如壓力，循環時間和總刺激週期。 此外，GUI實時顯示壓力，該壓力由連接到壓力室的壓力傳感器（RS Components，Corby，UK）測量。
壓力由市售的空氣冷卻氣體壓縮機（Jun-Air，Redditch，UK）產生（圖1D ），其從培養箱吸入空氣並將其壓縮至8巴的最大壓力。 空氣在定制的加濕器中保濕，以防止壓力室內的孔中的介質蒸發。 通過壓力室後，空氣被轉移回培養箱，關閉環路。
實驗計劃和機械刺激協議
將hASC培養2-3週直至達到所需的細胞濃度。 然後，收穫細胞並離心以形成顆粒。 收穫和造粒的日期定義為實驗的第0天。 將顆粒分成3個實驗組（無刺激，HP刺激，21天無刺激，隨後HP刺激21天）（圖2A ）並培養至第42天，每7天收集樣品。 所有實驗組在整個實驗期間經歷DM。
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實驗研究設置。 （ A ）將人ASCs培養2-3週直至達到所需的細胞濃度。 然後，將每個沉澱物250,000個細胞離心以誘導沉澱形成，其在3天內完成。 將顆粒分成3組：未刺激的靜態對照42天（nHP），靜水壓力刺激（HP）42天，21天無刺激，隨後HP刺激21天（nHP→HP）。 在第0天，第3天和第7天以及從第七天開始在實驗的總時間段內收穫小丸。 （ B ）靜水壓力刺激方案。 在初始顆粒形成3天后，將顆粒以2秒開/關方式進行4小時的間歇刺激，最大和最小壓力分別為4和0巴。 每個刺激階段之後是20小時的無壓力期。 該方案每周連續5天重複，中間休息2天。 重複該模式直至第42天的實驗結束。 |
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HP刺激的顆粒以2秒的開/關方式進行4小時的間歇刺激，最大和最小壓力分別為4和0巴。 每個刺激階段之後是20小時的無壓力期。 每周連續5天重複該方案。 重複該模式直至第42天的實驗結束（圖2B ）。
組織學和免疫組化（IHC）分析
將收穫的沉澱培養物在4％甲醛（Histofix，Roth，Karlsruhe，Germany）中於4℃固定24小時，並用分級系列的乙醇步驟（50％至100％）脫水。 將樣品包埋在石蠟中，切成5μm，並安裝在載玻片上。 為了進行不同的染色，將切片用二甲苯（Roth，Karlsruhe，Germany）脫石蠟，並用分級系列的乙醇洗滌液再水化成蒸餾水。 通過阿爾新藍染色檢測糖胺聚醣（GAG）。 簡言之，通過Alcian blue 8GX（Sigma，St.Louis，MO，USA）進行阿爾新藍染色30分鐘，然後用蒸餾水沖洗直至切片清潔。 然後，將載玻片用Mayers Hemalum（Roth，Karlsruhe，Germany）複染2分鐘，並在流動的自來水中沖洗10分鐘。 然後，將切片用分級系列的乙醇洗滌液脫水，用二甲苯（Roth，Karlsruhe，Germany）清洗並用載玻片覆蓋。
通過IHC染色檢測I型和II型膠原蛋白，以評估顆粒培養物的軟骨組織形成的質量。 簡而言之，通過在40℃下將石蠟包被的樣品乾燥過夜進行I型膠原染色，同時將膠原II型染色在60℃下乾燥30分鐘。 然後將樣品脫石蠟並用3％H 2 O 2 （Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）封閉內源性過氧化物酶10分鐘並用蒸餾水沖洗。 將載玻片在檸檬酸三鈉緩衝液（pH6.0）（ZUC028-500，Zytomed，Berlin，Germany）中蒸發20分鐘用於I型膠原蛋白或用胃蛋白酶溶液（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）在37℃處理10分鐘。對於II型膠原，然後用Tris緩衝鹽水（TBS）沖洗5分鐘。 將樣品在馬血清（S-2012，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）中孵育20分鐘，與第一抗體（兔多克隆抗膠原蛋白1（Abcam，Cambridge，United Kingdom））孵育;小鼠單克隆抗膠原蛋白2（MS-306-PO，Thermo Fisher，Waltham，MA，USA））在室溫（RT）下1小時，用TBS沖洗5分鐘並與第二抗體（I型膠原：山羊抗兔過氧化物酶）一起孵育標記為IG（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）; II型膠原：山羊抗小鼠過氧化物酶標記的IG（K4001，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA））在室溫下30分鐘，然後用TBS漂洗持續5分鐘 為了檢測，將切片與2-3滴VECTOR NovaRED（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）一起溫育3分鐘，並通過浸沒在水中10分鐘來終止反應。 然後，將載玻片用Hemalum（Roth，Karlsruhe，Germany）複染1分鐘並在自來水中變藍10分鐘。 將載玻片脫水，用二甲苯（Roth，Karlsruhe，Germany）清洗並用載玻片覆蓋。
通過電子順磁共振（EPR）測量確定活性氧（ROS）
將分化培養基與500μM旋轉探針環羥胺1-羥基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷鹽酸鹽（CP-H; Noxygen，Elzach，Germany）在刺激下孵育4小時（4巴） ，2 s / 2 s模式）或靜態條件下。 另外，為了進一步闡明其潛在機制，將鐵螯合劑二乙烯三胺五乙酸（DTPA），超氧化物歧化酶（SOD）或DTPA和SOD兩者加入到培養基中。 為了分析，將培養基置於100mL的1mL一次性移液管（VWR International，Radnor，PA，USA）中並在液氮中快速冷凍。 使用Magnettech MiniScope MS 200 EPR光譜儀（Magnettech Ltd.，Berlin，Germany）在3359±200G下記錄冷凍樣品的EPR光譜25 。 一般設置如下：調製頻率100kHz，微波頻率9.425GHz，微波功率11mW，調製幅度7G。 計算氧化的CP-H（3-CP）信號的大小並以任意單位（AU）表示。
定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）
通過在組織勻漿器（Precellys®24; Bertin corp。，Rockville，MD，USA）中用組織研磨珠（Bertin corp。，Rockville，MD，USA）切碎粒料，在第0,21和42天收穫細胞，隨後通過使用peqGOLD總RNA試劑盒（VWR International，Radnor，PA，USA）進行總mRNA提取。 使用NanoPhotometer（Implen GmbH，München，Germany）測量RNA，並使用oligo（dT）引物，使用EasyScript TM cDNA合成試劑盒（abm，Richmond，BC，Canada）將1μgmRNA轉錄成cDNA。 使用KAPASYBR®FASTqPCR試劑盒（VWR International，Radnor，PA，USA）和Stratagene©Mx3000P QPCR系統（Agilent，Santa Clara，CA，USA），根據製造商的說明書，使用每個反應10ng cDNA進行定量PCR。 。 熱循環條件是在95℃下5分鐘，然後是在95℃下10秒和在60℃下30秒（B2M，MMP3，RUNX2，IL6）或在95℃下30秒和在60℃下1分鐘的40個循環。 C（ACAN，COL1A1，COL2A1，COL10A1，SOX9，MMP9，MMP13，IL-1β，IL-6，TNF-α。 對於時間依賴性表達譜，將靶基因標準化為管家β2-微球蛋白（B2M），並使用比較CT（ΔΔCT）方法與第0天的相應值進行比較。 使用的引物序列列於表1中 。
表1用於qPCR的引物序列。
矩陣組件的量化
進行生化測定以定量GAG和DNA含量。 因此，將沉澱物在液氮中快速冷凍並用500μL蛋白酶K溶液（≥30單位/ mL蛋白酶K，50mM TRIS，1mM EDTA，1mM碘乙酰胺，10μg/ mL胃蛋白酶抑製劑A在ddH 2 O中）消化。在56°C過夜。GAG量化
使用基於二甲基亞甲基藍（DMMB）的染色測定法測定沉澱培養物的GAG含量。 簡言之，將5μL蛋白酶K消化的樣品用95μL磷酸鹽緩衝的EDTA（100mM Na 2 HPO 4和10mM EDTA的PBS溶液）在平底96孔板中稀釋，並用軟骨素-4稀釋系列稀釋。製備1.75mg / mL半胱氨酸的硫酸鹽作為標準。 將100μL稀釋的樣品或標準物與200μLDMMB溶液（38.5μMDMMB，1％EtOH，40.5mM NaCl，40.5mM甘氨酸和9.5mM乙酸在ddH 2 O中）混合，並測量樣品的吸光度。使用讀板器（Sunrise Basic; Tecan Trading AG，Männedorf，Switzerland）將540nm對595nm作為參考波長。
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DNA定量
使用QuantiFluor®dsDNA試劑盒（E2670; Promega，Madison，WI，USA）定量沉澱中存在的DNA。 簡言之，將5μL蛋白酶K消化的樣品用95μL1Xtris-EDTA（TE）緩衝液在黑色平底96孔板中稀釋，並使用提供的Lambda DNA Standard產生標準曲線。 將樣品和標準品與100μL1XQuantiFluor®dsDNA染料混合，並在室溫（RT）下在黑暗中孵育5分鐘，然後使用GloMax進行熒光測量（藍色熒光光學試劑盒; 490 nm Ex / 510-570 nm Em ）進行了®-Multi +檢測系統（Promega，Madison，WI，USA）。
生存能力評估
使用標準甲基噻唑基二苯基 - 四唑溴化物（MTT）方法，通過比色測定評估沉澱中的細胞活力。 因此，將顆粒刺激4小時（4巴，2秒/ 2秒模式）或在靜態條件下培養。 將沉澱物轉移到48孔板中並與500μLMTT工作溶液（650mg / mL MTT在ddH 2 O中）一起溫育2小時。 棄去MTT工作溶液並將生成的甲in溶解在500μlDMSO中1小時。 使用平板讀數器在540nm波長對650nm處測量吸光度作為參考波長。
蛋白質印跡
將PBS洗滌的顆粒在液氮中快速冷凍並用鑷子粉碎成粉末。 將粉末在Nonidet P-40緩衝液中重建，該緩衝液含有40mM HEPES（pH 7.9），120mM NaCl，1mM EDTA（pH 8.0），10mM 2-甘油磷酸鹽，50mM NaF，0.5mM Na 3 VSO 4,1 ％ Nonidet P-40替代品和1mM苯基 - 甲基 - 磺酰氟（PMSF），補充2μg/ mL抑肽酶，2μg/ mL亮肽素，0.3μg/ mL苯甲脒氯化物和10μg/ mL胰蛋白酶抑製劑並裂解。 通過幾次冷凍和解凍循環提取顆粒的總蛋白質。 將蛋白質提取物在冰上溫育1小時，並在4℃下以22,000×g離心20分鐘。 收集每個樣品的上清液，轉移到新的小瓶中，並使用Bradford測定法（Protein Assay Dye Reagent Concentrate; Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在NanoPhotometer（Implen GmbH，Munich，Germany）上測定蛋白質濃度。製造商的說明。 在SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10％運行凝膠和5％堆積凝膠）上向每個泳道施加等量的蛋白質（10μg/泳道）並在增加的電壓（60,80,100V）下運行。 然後，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom）上，並用含有0.1％吐溫（TBS / T）的TBS緩衝液中的5％脫脂奶粉封閉。 將一抗在4℃下在5％BSA的TBS / T中孵育過夜，並將二抗在室溫下在TBS / T中的5％脫脂奶粉中孵育1小時。 使用Odyssey Fc成像系統（LI-COR，Lincoln，NE，USA）檢測信號，並用Image Studio Lite（LI-COR，Lincoln，NE，USA）評估，以產生磷酸化蛋白質與總蛋白質或管家的比率。 。 磷酸-AKT（Ser-473），總AKT，磷酸-p44 / 42 MAPK（Thr-202 / Tyr-204）（磷酸-Erk1 / 2），總p44 / 42 MAPK（總ERK1 / 2），磷酸化合物的抗體-p38 MAPK（Thr-180 / Tyr-182），總p38 MAPK，磷酸-S6核醣體蛋白（Ser-240/244），總S6核醣體蛋白，β-連環蛋白和GAPDH獲自Cell Signaling Technology（Danvers， MA，USA）。 第二抗體IRDye®680RD山羊抗小鼠IgG，IRDye®680LT驢抗兔IgG，IRDye®800CW山羊抗小鼠IgG和IRDye®800CW山羊抗兔IgG獲自LI-COR Biosciences（Lincoln，NE） ， 美國）。
統計分析
除非另有說明，否則所有數據均表示為平均值+標準偏差（SD）。 使用GraphPad Prism軟件（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）進行所有統計學計算。 使用D'Agostino-Pearson綜合測試測試值的正態分佈。 使用Mann-Whitney U檢驗或單因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比較檢驗或Kruskal-Wallis檢驗和Dunn多重比較檢驗分別計算兩組或多組之間的比較。 P值 <0.05被認為具有統計學意義。
結果
通過靜水壓力（HP）產生活性氧（ROS）
在一系列EPR實驗中，驗證了HP刺激導致的ROS形成，並闡明了所涉及的活性氧物種和機制。 與未刺激的對照培養基相比，DM的刺激導致ROS水平高約5倍（圖3A ）。 添加DTPA以顯示鐵離子參與自由基生成過程。 添加鐵螯合劑導致ROS產生顯著降低，而SOD的添加導致高水平的ROS。 SOD將超氧化物轉化為過氧化氫（H 2 O 2 ），然後進一步轉化為羥基自由基（HO • ）。 SOD的轉化驅使Fe 2+和O 2對Fe 3+和超氧化物的主要反應，導致高ROS水平（圖3B ）。 同時添加到分化培養基中的SOD和DTPA阻礙了ROS的積累，因為檢測到的水平與單獨的DTPA添加相似。
通過靜水壓力刺激形成無細胞ROS。 （ A ）根據所述壓力方案刺激沒有細胞的DM，並使用旋轉探針CPH測量產生的活性氧物質（ROS）。 加壓DM顯示出比未加壓培養基高5倍的ROS。 將DTPA添加到培養基中以捕獲游離鐵（Fe 2+ / Fe 3+ ）導致ROS（DM + DTPA）的顯著減少。 相反，SOD的添加導致ROS（DM + SOD）的積累增加。 與未刺激的培養基相比，加壓組在刺激的培養基中顯示幾乎兩倍的ROS量。 同時添加SOD和DTPA（DM + DTPA + SOD）阻礙了ROS的積累並導致ROS水平與僅添加DTPA的組相當。 插圖：3-CP的EPR信號。 （ B ）靜水壓力刺激增加介質中的氧分壓。 與游離鐵（Fe 2+ ）組合，產生超氧化物（O 2 · - ），其通過SOD進一步轉化為過氧化氫（H 2 O 2 ）。 然後H 2 O 2可與游離鐵（Fe 2+ ）相互作用以產生羥基自由基（HO 2）。 使用DTPA結合游離鐵減少了超氧化物的產生，因此也產生了其他ROS。 * p <0.05，*** p <0.001。
HP刺激可防止軟骨基質形成
通過組織學分析培養長達42天的顆粒，研究升高的ROS水平對沉澱培養物中軟骨基質形成的影響。 在沉澱形成後三天，根據所述 的壓力方案用HP刺激一組沉澱（圖2B ），而未刺激的一組沉澱用作對照。 這些未刺激的顆粒顯示出軟骨特異性細胞外基質（ECM）組分膠原蛋白II和GAG的陽性染色增加，分別通過免疫組織化學和阿爾新藍染色染色（圖4 ）。 與未刺激的顆粒相比，HP處理的顆粒幾乎沒有形成膠原蛋白II，只有低表達的GAGs。 在兩組中，膠原蛋白I基本上表達; 在刺激組中，通常在整個沉澱中，而在未刺激的對照組中，染色限於沉澱的外部區域。
在靜態和靜水壓力刺激（HP-stim）條件下軟骨形成ASC-沉澱培養物的組織學分析。 靜態軟骨形成培養的顆粒隨時間顯示出增加量的糖胺聚醣（通過阿爾新藍染色測定）和膠原蛋白II（通過免疫組織化學染色測定）。 相反，HP刺激的顆粒對這些標記物是陰性的，但在42天的完全培養時間內顯示出膠原蛋白I的均勻分佈。 靜態顆粒也表達膠原蛋白I，尤其是在較早的時間點，但通常在顆粒的外部區域（由黑色箭頭表示）。 比例尺：100μm。
HP刺激降解預先形成的軟骨基質
在觀察HP刺激對沉澱培養物中軟骨形成的抑製作用後，重點是確定HP刺激是否也導致軟骨基質的降解。 因此，將未刺激的靜態沉澱培養物培養21天，其中形成顯著量的GAG和膠原蛋白II。 然後將顆粒再接受HP刺激21天（圖2A ）。 作為對照，將顆粒在靜態條件下培養總共42天而不刺激。 靜態培養21天后，觀察到GAG和II型膠原的陽性染色（圖5 ），其在靜態條件下進一步增加，但隨著時間的推移在刺激組中減少。 HP刺激導致整個顆粒中均勻的膠原蛋白I表達，而在靜態對照中，只有顆粒的邊緣被陽性染色。
靜態和開關靜水壓（nHP→HP）刺激條件下軟骨形成ASC-沉澱培養物的組織學分析。 直到第21天，在靜態條件下培養兩組的顆粒，並形成大量的GAG（通過阿爾新藍染色測定）和I型和II型膠原（通過免疫組織化學染色測定）。 然後，靜態顆粒培養物逐漸增加GAG含量以及膠原蛋白II含量，而膠原蛋白I含量逐漸降低並且僅在顆粒結構的外殼中局部表達（由黑色箭頭指示）。 在轉換條件下培養的小丸在第21天后穩定地丟失促軟骨形成標記物（阿爾新藍，膠原蛋白II），但在整個小丸中顯示出增加的膠原蛋白I含量。 比例尺：100μm。
定量GAG對DNA含量的測量證實了HP刺激以雙重方式影響GAG含量的組織學染色分析：（1）與未刺激的靜態對照相比，從第3天開始刺激的顆粒顯示出抑制的GAG沉積和（2）在轉換條件下的顆粒顯示出減少GAG含量，表明已經形成的ECM基質的降解（圖6 ，補充圖S1A ）。 儘管第21天后刺激的顆粒的GAG / DNA量從第28天到第35天略有增加，但第42天的最終比例（3.2μgGAG/μgDNA）低於靜態的原始值（5.4μgGAG/μgDNA）第21天培養的顆粒。連續刺激42天的顆粒顯示，與未刺激的顆粒相比，第21天產生的GAG顯著差異，在第42天逐漸增加至10倍的差異。與連續刺激的顆粒相似，刺激的顆粒在第21天（在軟骨形成前分化階段之後）與靜態培養顆粒相比，在第42天顯示出顯著的7倍差異。
靜水壓力刺激對定量糖胺聚醣（GAG）對DNA量的影響。 靜培養顆粒在6週的培養期內逐漸增加GAG與DNA的比率，並且在連續HP刺激的顆粒上表達10倍的差異，並且在第42天表達與轉換的刺激的顆粒的7倍差異。 在第21天，與未刺激的顆粒相比，連續刺激的顆粒顯示產生的GAG減少。 切割受刺激的顆粒在靜態條件下培養21天，然後經歷靜水加載另外21天，在第28天和第35天略微增加GAG / DNA比例，但在第42天具有GAG與DNA的比例，類似於與HP連續培養的顆粒。為期42天。 在各個條旁邊的阿爾新藍染色顆粒的代表性實例定性地強調了定量GAG與DNA比率的結果。 來自3個捐助者的數據，每個捐助者4個重複; ** p <0.01，**** p <0.0001。
HP刺激隨著時間的推移降低了顆粒的活力
除了對軟骨形成的抑制和退化作用，特別是對GAGs（補充圖S1B ），經受HP刺激的小丸顯示出減少量的DNA（補充圖S1C ）。 DNA量在第0天最高，但在一周內降低以穩定並且對於靜態培養的顆粒的其餘實驗保持在相同水平。 相反，連續刺激的顆粒的DNA量從第7天開始逐漸減少至第42天的起始值的50％以下。類似地，轉換刺激的顆粒的DNA從第28天開始逐漸下降並在第42天達到其最低值。此外，為了提高短期DNA數據的有效性，在刺激一天以及刺激一周後檢查顆粒的活力（補充圖S1D ）。 HP刺激的一天不會對受刺激的顆粒產生任何不利影響。 類似地，一周的刺激對顆粒也沒有顯著影響，這與第7天的DNA數據一致（補充圖S1C ）。
RT-qPCR的靜水壓（HP）降低II型膠原蛋白與I的比例
使用RT-qPCR追踪軟骨特異性基因的轉錄水平。 通常用作軟骨分化指數26的 II型膠原蛋白與膠原蛋白I型mRNA水平（COL2 / COL1）的比率僅在培養21天后受刺激的顆粒中顯著降低，而靜態和任何HP-之間沒有顯著差異。在第42天可以檢測到刺激組（圖7 ）。 研究II型膠原蛋白和I型膠原蛋白mRNA的水平分別揭示了HP刺激的膠原蛋白I型mRNA表達比II型膠原蛋白更強。 在第21天以及所有組的第42天，靜脈和刺激組之間的軟骨特異性膠原II型表達是相當的。 刺激組的I型膠原蛋白水平在第21天顯著上調，但與第42天的其他組相比沒有顯示出差異。與組織學染色相比，聚集蛋白聚醣（一種蛋白多醣和關節軟骨的主要結構成分）的表達顯著上調。在刺激的顆粒中第21天，但在第42天在所有組中均等表達。 與聚集蛋白聚醣相似，X型膠原蛋白是肥大軟骨細胞的早期標誌物，在第21天顯著上調，但與對照相比，在第42天的任一HP刺激組均未受影響。
HP刺激上調轉錄因子SOX9和RUNX2的表達
與第21天的對照相比，HP刺激後軟骨細胞的關鍵轉錄因子SOX9的表達顯著上調，但在第42天在所有組中均等表達（圖8 ）。 類似地，RUNX2是關鍵的成骨細胞轉錄因子，在第21天在受刺激的顆粒中顯著上調，但在第42天在所有組中均等表達。
HP刺激的沉澱培養顯示基質金屬蛋白酶（MMPs）的增強表達
在觀察到HP處理的顆粒中GAG和II型膠原的損失後（圖4 ），研究了基質金屬蛋白酶的表達 - 這是軟骨重塑和骨關節炎中必不可少的。 MMP3（例如已知降解軟骨蛋白多醣），MMP9（例如已知降解不同類型的膠原）和MMP13（例如已知切割II型膠原）被描述為過度刺激和/或骨關節炎軟骨中軟骨基質降解的主要介質27 ， 28 。 在第21天，與未刺激的對照顆粒相比，HP刺激後所有三種MMP的表達顯著上調（圖9 ）。 在第42天，MMP3和MMP9的表達水平在刺激和靜態培養的顆粒之間沒有顯著差異。 與靜態對照相比，HP刺激的小鼠組僅MMP13表達增強，從第3天開始，HP刺激的小丸顯著上調。 兩種HP刺激方案之間沒有觀察到差異。
靜水壓（HP）刺激增加基質金屬蛋白酶蛋白的基因表達。 在第21天，所有研究的MMP（MMP3，MMP9和MMP13）的基因表達在流體靜力刺激的顆粒中顯著上調。在第42天，MMP9和MMP13在兩個HP刺激的組中具有更高的表達，其中MMP13與連續刺激的組顯著不同。 來自3個捐助者的數據，每個捐助者5個重複; * p <0.05，** p <0.01，**** p <0.0001。
通過HP刺激上調OA相關的促炎細胞因子
為了研究HP刺激對炎症相關細胞因子表達的影響，研究了OA-IL-1β，IL-6和TNF-α中通常上調的三種不同的促炎細胞因子（圖10）。 ）。 在第21天，與靜態對照相比，HP刺激的小丸顯示所有三種細胞因子的表達水平增加，IL-1β和TNF-α顯著不同（p <0.0001）。 在第42天，可以觀察到所有三種沉澱條件之間的差異，並且與靜態對照顆粒相比，對於所有3種研究的細胞因子，HP-刺激組中的水平呈現升高的趨勢。 有趣的是，對照組中IL-1β和IL-6的表達在第21天低於第0天。
蛋白質印跡
在基因表達分析之後，與未刺激的靜態顆粒相比，在轉換刺激的顆粒組（nHP→HP）中研究了上調的炎性細胞因子-ERK1 / 2和p38MAPK的顯著信號靶標。 對與OA相關的蛋白質的免疫印蹟的分析（圖11A ）顯示，與未刺激的靜態沉澱培養物相比，從第21天開始，刺激的沉澱顯示出更高的ERK1 / 2活化（圖11B ）。 這種趨勢持續一段時間並在第35天達到最大值，但在刺激期結束時（顆粒培養第42天）下降。 相反，p38MAPK沒有遵循這樣的模式，具有相當的刺激和靜態顆粒的早期活化水平（圖11C ）。 核醣體蛋白S6也是如此（圖11D ），其參與細胞大小和細胞增殖的調節。 此外，Akt是經典mTOR途徑的主要成分和炎性細胞因子的下游靶標，顯示出與ERK1 / 2類似的激活譜。 與未刺激的顆粒相比，HP刺激的顆粒在整個實驗期間的每個時間點對Akt顯示出更高水平的活化（圖11E ）。 為了研究另一種可能的OA觸發因素，研究了β-連環蛋白。 與第21天的未刺激的顆粒相比，刺激的顆粒在刺激期結束時顯示出增加的表達模式，而未刺激的顆粒中的表達逐漸減少（圖11F ）。
靜水壓（HP）刺激後骨關節炎中關鍵信號通路的激活。 （ A ）使用GAPDH作為管家蛋白，裁剪來自相同凝膠的代表性免疫印跡以顯示Akt，ERK1 / 2，p38，核醣體蛋白S6以及β-連環蛋白的磷酸化和總蛋白的特異性條帶。 全長印跡在補充圖S2中給出 。 在實驗的最後21天，每週一次收穫未刺激和HP刺激組的顆粒，並分離蛋白質。 在所有時間點，與靜態對照相比，（ B ）ERK1 / 2和（ E ）Akt在HP刺激的顆粒中顯示出統計學上顯著的活化增加。 （ C ）p38的蛋白質表達隨時間沒有顯著變化。 （ D ）核醣體蛋白S6，ERK1 / 2和mTOR的下游靶標，在任何取樣時間點都沒有表現出增強的活化。 （ F ）刺激的顆粒在刺激期結束時β-連環蛋白的表達增加，而未刺激的顆粒則表達下降。 平均值+ SEM; 來自2個捐助者的數據，每個捐助者6個重複; * p <0.05。
討論
骨關節炎（OA）對全球越來越多的人來說是一種負擔，特別是由於導致OA的風險因素的流行率增加，例如肥胖和久坐不動的生活方式29 。 儘管在過去20年中進行了大量研究，但對導致這種退行性關節病的發生和發展的觸發因素和機制的詳細了解仍然不完整30 。 從歷史上看，OA被描述為一種簡單的“磨損”型疾病，但現在被認為是一種更複雜的疾病，其中炎症過程起著至關重要的作用3 。 在最近發表的研究中，氧化應激引起的ROS水平升高與軟骨退化的形成和進展有關，如OA 6,31,32所示。在所提出的研究中，通過定制的生物反應器系統（圖1 ）應用靜水壓力（HP）導致無細胞ROS的產生。 通過一系列EPR測量，我們可以證明最初產生超氧化物（O 2 • - ），其隨後反應產生其他ROS（圖3 ），包括過氧化氫（H 2 O 2 ）和羥基自由基（HO•）。 值得注意的是，增加的HP導致產生升高水平的無細胞ROS。 有趣的是，在受OA影響的關節33,34中也描述了升高的HP水平。 在膝關節中，這些升高的關節內液壓水平歸因於超過80％的患者出現的積液35,36 。 關節內液壓升高的另一個原因是體重，這是眾所周知的OA風險因素。 在這方面，Felson 等人 。 描述了在行走期間增加10磅體重導致膝蓋上的負荷增加約30磅。 一般而言，過度關節負荷，無論是單次急性撞擊事件還是重複累積接觸應力，都被認為是OA 38,39發病機制的主要原因。 通過使用生物反應器系統17,40,41模擬關節負荷的體外研究，可以證明關節軟骨的過度機械刺激引發ROS和活性氮物質的產生。 然後，這種氧化應激是與OA相關的特徵性炎症過程的主要觸發因素。
另外，EPR測量表明，游離鐵是HP刺激後無細胞ROS形成的關鍵組分。 值得注意的是，患有退行性關節疾病（如類風濕性關節炎和OA 42,43）的患者已經表明滑膜鐵水平升高。 鐵的來源被認為是由於滑膜42的發炎區域的創傷或分泌而進入關節的血液。 關節出血導致血紅蛋白釋放鐵，誘導由細胞因子和羥基形成介導的炎症環境44,45 。 已經研究了非蛋白結合鐵作為觸發因素，但也作為退行性關節疾病的標誌物46 。 在這方面，Kawai 等人 。 圖47顯示IL-1處理的大鼠發生關節炎，與鹽水處理的對照相比，滑膜液中的游離鐵水平在統計學上更高。
人們一致認為活性氧和氮物種水平的升高會直接損害軟骨細胞，例如脂質過氧化48或DNA損傷49 ，導致II型膠原蛋白和GAG合成受損，以及基質金屬蛋白酶（MMPs） 50的表達增強， 51,52 。 此外，ROS，特別是過氧化氫，被描述為碎裂連接蛋白並抑制蛋白多醣單體與其他ECM組分（例如透明質酸）的結合53,54 。 在所提出的研究中也可以看到上述雙重效應。 HP刺激，從而產生ROS，導致已經形成的GAG和II型膠原的減少（圖5 ）以及抑制軟骨形成MSC顆粒中這些軟骨特異性ECM蛋白的形成（圖4 ） 。 儘管培養基含有有效的軟骨生長因子TGF-β3和BMP6，但仍發生降解作用。 我們可以清楚地表明HP刺激顯著上調所有三種研究的MMP 3,9和13的表達（圖9 ）。 這進一步伴隨著軟骨形成預分化顆粒中軟骨基質蛋白隨時間的嚴重損失。 該研究的一個限制是，如果軟骨基質的形成直接受到干擾必需的軟骨形成信號傳導途徑，基質降解MMP的表達或兩種效應的結果，仍有待研究。 另一個最可能另外影響受刺激的顆粒的GAG含量降低的因素是由於HP誘導的氧化應激誘導的細胞凋亡。 HP處理的顆粒顯示出顯著較低量的DNA，其可與細胞數量減少直接相關。 儘管可能誘導細胞凋亡，但未檢測到對細胞活力的直接影響（補充圖S1 ）。 因此，需要在未來的研究中執行更具體的實驗來解決這些問題並破譯詳細的機制。
與II型膠原蛋白和GAG下調相反，I型膠原蛋白表達上調，這可以在RT-qPCR（圖7 ）以及組織學分析（圖4和5 ）中看到。 I型膠原蛋白的上調另外有助於II型膠原蛋白與I型膠原蛋白比率的降低，其已被用作健康軟骨細胞26,44,55的分化標誌物。 值得注意的是，在實驗裝置中對ROS的暴露並未伴隨III型膠原蛋白的表達（數據未顯示），因為Hosseininia 等人已經描述了關節軟骨受損區域。 56 ，與皮膚或肌腱中的傷口癒合和瘢痕組織形成相當57,58 。
我們研究中的基因表達分析還包括OA相關細胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6。 據報導，細胞因子表達的上調可能與ROS水平升高有關，並且可能在OA的發病機制中起重要作用。 例如，戴維斯等人 。 證明IL-1β介導骨關節炎軟骨中ROS誘導的DNA損傷59 。 有趣的是，與第0天水平相比，第21天對照顆粒中的IL-1β和IL-6表達降低（圖10 ），這可能是由造粒過程中的機械應力引起的。 此外，這些白細胞介素對關節軟骨的分解代謝作用與不同信號傳導途徑的激活有關，包括MAPK / ERK和PI3K / Akt。 不同研究報導ERK途徑是軟骨形成的負調節因子。 例如，Wang 等人 。 表明IL-1β增強MMP3和MMP13的表達，但通過同時MAPK / ERK途徑激活抑制II型膠原和聚集蛋白聚醣。 在這方面，Mio 等人 。 已經表明，ERK途徑激活導致靜水壓力處理的軟骨細胞中SOX9表達的抑制61 。 機械負載誘導的ERK1 / 2磷酸化導致軟骨外植體培養物中蛋白多醣合成的減少62 。
與未預先分化成軟骨細胞譜系21天的顆粒相比，在未刺激的靜態培養物中研究了包括ERK1 / 2和Akt的不同信號傳導途徑，其中誘導了OA樣條件（nHP→HP，圖11 ）。 根據文獻63 ，在所提出的研究中OA相關基因和蛋白質表達的上調可能與ERK1 / 2激活增加有關。 與MAPK / ERK類似，PI3K / Akt信號傳導途徑也通過HP刺激治療激活。 由於其廣泛的靶蛋白質如mTOR，NF-κB，GSK-3β和p5364，PI3K / Akt途徑的激活可導致不同的調節。 然而，據報導，PI3K / Akt參與OA調節和進展，因為其過度活化導致軟骨細胞炎症和細胞凋亡[ 65,66] 。 與未刺激的樣品相比，Akt的活化和由此誘導的細胞凋亡可與觀察到的HP刺激組中顆粒大小和DNA含量降低相關（圖4和5 ，補充圖S1 ）。 有趣的是，Lopez-Armada 等人 。 67提出細胞凋亡可導致ROS產生增加，這可能促進軟骨細胞死亡。
除Akt和ERK1 / 2外，其他靶標包括p38 MAPK和β-Catenin均被激活但不太明顯; 在第21天，相對於未刺激的對照，p38MAPK和β-連環蛋白的活化僅高1.5倍，在這方面，Cheleschi 等人的激活高達4倍。 可以證明，循環HP可以降低OA軟骨細胞中的β-連環蛋白表達，因此這可能是恢復表達在OA中失調的miRNA表達的關鍵調節劑，導致包括MMP13在內的蛋白酶顯著減少。 所描述的生物反應器系統對這些信號傳導途徑的影響可能通過重複實驗在統計學上得到驗證，所述信號傳導途徑先前已證明涉及OA起始和進展68,69 。
與其他信號分子不同，核醣體S6蛋白似乎沒有被HP刺激激活。 這與其他研究形成對比，這些研究表明，通過mTOR的藥理學和遺傳缺失，在臨床前和動物模型中可以降低OA的嚴重性。
該研究主要描述了由於HP處理對ASC軟骨形成顆粒所觀察到的無細胞ROS形成的影響，但沒有研究機械變形對細胞完整性的直接影響。 在文獻中，HP治療被描述為導致2D培養的OA-軟骨細胞11,13的超微結構和細胞骨架變化。 需要進一步的研究來闡明所應用的HP是否同樣導致在沉澱培養物中培養的單個細胞的細胞骨架的變化。
結論/展望
總之，利用能夠產生無細胞ROS的定制靜水壓力生物反應器系統來產生OA的體外模型，其產生與退行性關節疾病的起始和進展相關的相當的生物學效應。 在未來的研究中，所創建的系統將用於測試許多藥物的抗氧化特性，這些藥物被提議作為潛在的OA治療71 ，例如桃葉珊瑚苷17或薑黃素72 。 另一種可能的應用可以涉及OA中存在的游離鐵和氧應激相關信號傳導途徑的參與，以闡明未來治療方法的可能的新靶標。
來源：https://www.nature.com/articles/s41598-018-34718-8
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